Wizerunek Madonny Miłosierdzia namalowany został na deskach dębowych techniką temperową na podkładzie klejowo-kredowym. Obraz ma wymiary 200 na 165 cm. Jest umieszczony na ścianie zewnętrznej, patrząc od strony miasta. Na przeciwległej ścianie znajduje się duże okno, z którego widać starówkę (w Panu Tadeuszu brama zostaje obrócona).

Autor obrazu nie jest znany. Niektórzy przypisują autorstwo Łukaszowi – artyście krakowskiemu, który podobny obraz namalował w 1624 dla kościoła Bożego Ciała w Krakowie. Według legendy Matka Boska ma rysy Barbary Radziwiłłówny.

Zdaniem prof. Marii Kałamajskiej-Saeed pierwowzorem zarówno obrazu krakowskiego jak i wileńskiego był obraz flamandzkiego malarza Martina de Vosa, namalowany ok. 1580 w dwóch wersjach graficznych, różniących się układem rąk.

Pierwszy z tych wariantów, rytowany przez Hieronima Wierixa, przedstawiający Maryję ze skrzyżowanymi na piersi rękoma, stał się wzorem dla obrazu ostrobramskiego, natomiast według drugiego, rytowanego przez Antoniego Wierixa, namalowany został obraz Matki Boskiej krakowskiej, podobnej do Ostrobramskiej, mającej jedynie ręce złożone w geście modlitewnym[2].

Obecnie postać Maryi zakrywa błyszcząca złotem sukienka. Widoczna jest tylko wyrazista twarz i skrzyżowane na piersiach dłonie.

Pod metalową sukienką Ostrobramska Pani ubrana jest w czerwoną tunikę z podwiniętymi rękawami. Szyja okryta jest szalem, a głowa białą chustą. Całą postać okrywa zielonkawo-błękitny płaszcz zarzucony na głowę i ramiona. Tło obrazu ma odcień brązu.